产品简介 ※ 本试剂盒采用经典的SDS碱裂解法裂解细胞,离心吸附柱内的硅胶膜和树脂在高盐、低pH值状态下选择性的结合溶液中的质粒DNA,再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除,最后用低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅胶膜和树脂上洗脱。 ※ 采用进口硅胶膜,吸附量大,产率高,实验结果重复性好。 ※ 溶液中添加了作用指示剂,使每一步作用程度一目了然。 ※ 不需要使用有毒的苯酚,氯仿等试剂,也不需要乙醇沉淀。 ※ 快速、方便,从250~500 ml大肠杆菌LB(Luria Bertani)培养液中,可快速提取500~1000ug纯净的高拷贝质粒DNA,提取率达85~90%。 ※ 获得的质粒产量高,超螺旋比例高、纯度好。直接可以用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。 操作步骤: 1.试验前准备及注意事项 a. 溶液S1 Resuspension Buffer 使用前将RNase A(使用前稍离心)全部加入,均匀混合后4℃保存并标示。 b. Wash Buffer W1和Wash BufferW2 使用前请按标签加入无水乙醇并标示。 c. 使用前检查溶液S2、溶液S3各试剂是否有沉淀,若有请于37℃或微波炉稍加热溶解。S2可以在不烫手时使用,S3室温使用。 d. 溶液S2 Lysis Buffer及溶液S3用后盖紧瓶盖。 2. 收菌 取150~250ml 在LB 培养基中培养过夜的高拷贝数质粒菌液,或500 ml 过夜培养的低拷贝质粒/Cosmid菌液(若使用丰富培养基,菌液体积应减半或更少),≥3,000×g 离心10 min,弃上清。将离心管倒置于纸巾上数分钟,除尽上清。 6. 过滤 将上清全部转入过滤柱,3000×g 离心min,如过滤不完全,可以适当延长离心时间。 7. 柱结合 将上述操作的过滤溶液,全部转入至吸附柱中,10,000×g 离心2 min,如过滤不完全,可以适当延长离心时间弃滤液。 8. 漂洗 将13ml的漂洗缓冲液 加入吸附柱中,10,000×g 离心(4°C)2 min,弃滤液。 9. 再漂洗 将13ml的漂洗缓冲液 加入吸附柱中,10,000×g 离心(4°C)2 min,弃滤液。 空柱10,000×g 离心(4°C)2 min,除去残留乙醇。 注意:Elution Buffer 组成为2.5mM Tris-HCI (pH8.5),不影响测序和酶切反应,。把水或洗脱液加热于65℃使用时有利于提高洗脱液效率,如果提取的质粒>10kb,请将洗脱液预热至65℃,并适当延长洗脱时间。 质粒DNA浓度和纯度检测 OD260值为1,相当于50ug/ml的双链DNA。也可以通过DNA Marker通过琼脂糖凝胶电泳半定量。 OD260/ OD280比值一般为1.7-1.8,如果洗脱时不使用缓冲液,而使用去离子水,由于受PH值和离子浓度的影响,比值会偏低。
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