酵母细胞浓度检测测可采用分光光度计或平板培养法检测菌体量，一般对于酿酒酵母，OD600值为 1 . 0 时，相当于 1～2 X 10⁷cells / ml 。

3.酵母细胞壁的破除：

酶法：向菌体中加入 300μl Buffer SE 能，加入大约5μl Lyticase (约50U) ，充分混匀，并在摇床上 220rpm / min , 30℃处理30 min ～1小时。3000 x g离心 5 min，沉淀原生质球，小心弃去上清，收集沉淀。

注意：以上 Lyticase 的用量和处理时间为经验值，根据酵母菌株和酵母细

胞数量的不同，所用 Lyticase 的浓度和孵育时间应该进行适当调整。对于

酵母的不同菌株，孵育时间和酶量有所不同，后续操作裂解的程度取决于原生质球的数量。原生质球. 必须小心操作。

4. 加入 200μl溶液NS重悬沉淀。

5. 加入 20μl 蛋白酶 K 溶液，混匀。(蛋白酶K可根据血量或白细胞量适当增减) 注意：如果需要去除 RNA ，可加入 4μl RNaseA溶液（100 mg/ml用户自备 ) ，

振荡15秒，室温放置 5 分钟

3. 加 200 μl溶液BL，充分颠倒混匀， 56 ℃ 放置 10 分钟，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮（如溶液未彻底变清亮，请延长裂解时间至溶液清亮为止）。

注意：加入溶液BL时可能会产生白色沉淀，一般 56 ℃ 放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提DNA 量少和提取出的 DNA 不纯。当血液体积≤200ul 且没有采用红细胞裂解处理，或是样本储存条件不佳，水浴后颜色可能为深褐色，注意溶液中没有团块等沉淀。

4. 加 200μl 无水乙醇，充分颠倒混匀，冷却至室温。此时可能会出现絮状沉淀。（涡旋震荡10s可以提高收率）

5. 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱（吸附柱放入收集管中） , 12,000 rpm （~13,400×g ）离心 30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

6. 向吸附柱中加入700μl Buffer W1 （使用前请先检查是否已加入无水乙醇） , 12,000 rpm （~ 13,400×g ）离心 30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

7. 向吸附柱中加入 700 μl Buffer W2（使用前请先检查是否已加入无水乙醇） , 12,000 rpm （~ 13,400×g ）离心 30 秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中。

8. 再向吸附柱中加入 500 μl Buffer W2  , 12,000 rpm （~ 13,400×g ）离心 30 秒，倒掉收集管中的废液。

9. 将吸附柱放回收集管中， 12,000 rpm （~ 13,400×g ）离心 2 分钟，倒掉废液。将吸附柱置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。

10. 将吸附柱转入 1.5ml 离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50—200μl Buffer TE，室温放置 2—5 分钟（70℃保温得率更高）， 12,000 rpm （~ 13,400×g ）离心 2 分钟，将溶液收集到离心管中。

注意：若用水做洗脱液应保证其 pH 值在 7 .0—8 . 5 范围内（可以用 NaOH 将水的 pH 值调到此范围） , pH 值低于 7 . 0 会降低洗脱效率：且 DNA 产物应保存在 -20 ℃ ，以防 DNA 降解。

DNA定量及纯度检测

OD260值为1，相当于50ug/ml的双链DNA。也可以通过DNA Marker通过琼脂糖凝胶电泳半定量。

OD260/ OD280比值一般为1.7-1.8，如果洗脱时不使用缓冲液，而使用去离子水，由于受PH值和离子浓度的影响，比值会偏低。

常见问题